Un reciente trabajo de un equipo de investigación del CONICET en el Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR, CONICET-UNR), publicado en la prestigiosa revista Nucleic Acids Research, revela que el desarrollo de ciertas patologías puede deberse a cambios en la expresión de genes determinados por la formación de estructuras en el ADN llamadas cuádruplex de guanina.

Desde su descubrimiento, a principio de los años 50, algunos conceptos sobre el ADN son parte ya de la cultura científica. Por un lado, se asocia esta molécula con la identidad, es decir, como portadora de la información que define características que hacen único a cada individuo. Por otro lado, también se ha instalado la imagen de la doble hélice como representación de la forma que tiene la molécula de ADN. Esas largas cadenas en forma de hélice se construyen con la concatenación de pequeñas moléculas llamadas nucleótidos. Hay cuatro tipos de nucleótidos -adenina, guanina, timina y citosina- y la secuencia en la que se ordenan define la información que la célula decodifica como instrucciones para la síntesis de una proteína. A cada paquete de información se le denomina gen, y las regiones del ADN donde se los encuentra se llaman regiones codificantes.

Sin embargo, a medida que el conocimiento científico sobre el ADN avanza, algunos conceptos se revisan. Hoy se sabe que solo el 2 por ciento de los 3.000 millones de nucleótidos que forman el ADN humano son genes. El resto son regiones no codificantes (llamadas así porque no codifican para ninguna proteína) que muchas veces tienen funciones regulatorias, es decir, controlan cuándo, cuánto y cuáles genes se expresan en cada célula. Así mismo, hoy se comprende que las cadenas de ADN no siempre se ordenan en forma de hélice, sino que pueden adquirir conformaciones alternativas, mayormente en las regiones no codificantes.

Según Pablo Armas, investigador del CONICET y director del estudio, “cada vez hay más evidencias de que la arquitectura del ADN en las regiones regulatorias está muy vinculada a cómo se expresa un gen”. En este contexto toman protagonismo los cuádruplex de guanina, una estructura alternativa que toma normalmente el ADN cuando se dan arreglos específicos en la secuencia que combinan tétradas del nucleótido guanina. Aunque su descubrimiento es reciente, resulta claro que cuando estas estructuras se forman se modifica la expresión de los genes cercanos.

“Junto a Nora Calcaterra, investigadora del CONICET y co-directora del proyecto, nos preguntamos si los cuádruplex de guanina podían estar involucrados en la regulación de genes asociados a patologías, es decir, si existían alteraciones de la secuencia de ADN en las regiones regulatorias de estos genes que podían determinar la formación de cuádruplex donde no los había o que se dejaran de formar en un sitio donde debían encontrarse. Buscamos entender cómo estos cambios podrían incidir en el establecimiento de una enfermedad”, cuenta Armas, y revela que los resultados de esta investigación “abren puertas” para identificar nuevos factores genéticos involucrados en la oncogénesis y en múltiples patologías hereditarias.

Del algoritmo al cultivo celular: predecir in silico, confirmar in vitro

Para responder estos interrogantes desarrollaron una estrategia de búsqueda a partir de datos reportados de variantes genéticas en pacientes de patologías hereditarias. “Queríamos encontrar cuáles de las mutaciones que se encontraban en zonas regulatorias de los genes podrían estar afectando la formación de un cuádruplex de guanina”, explica Ernesto Piga, actualmente becario posdoctoral de CONICET, que realizó su tesis doctoral con esta investigación. “Comencé haciendo un trabajo más bien artesanal, descargando y clasificando la información de secuencias de las bases de datos, pero de repente el caudal de información era demasiado y decidimos buscar ayuda específica en bioinformática”. Entonces, Mauro Gismondi y Ezequiel Margarit del Centro de Estudios Fotosintéticos y Bioquímicos (CEFOBI, CONICET-UNR) se incorporaron al equipo; juntos pudieron desarrollar nuevos algoritmos para analizar las secuencias y predecir cuáles mutaciones podrían favorecer o desestabilizar la formación de cuádruplex de guanina.

De esta manera se fueron seleccionando secuencias de interés hasta llegar a la de cinco genes vinculados a distintas patologías (desórdenes del neurodesarrollo, fallas cardíacas, dermatitis atípicas, sordera, problemas de coagulación) que se tomaron para continuar con las siguientes etapas de la investigación.

“Primero comprobamos in vitro que las secuencias seleccionadas por la predicción bioinformática formaran efectivamente cuádruplex de guanina y que la mutación las afectara de la manera que esperábamos en base a esta predicción”, cuenta Agustín Lorenzatti, becario doctoral de CONICET y autor del trabajo, y destaca la labor de Andrés Binolfi, también investigador del CONICET en el IBR, que aportó los datos de alta resolución estructural que soportan esta comprobación con el uso de la Resonancia Magnética Nuclear.

Luego usaron líneas celulares humanas para insertar estas secuencias y analizar si la ocurrencia de estos cuádruplex de guanina tenía efecto en el nivel de expresión génica. Para ello asociaron las secuencias confirmadas a un gen que se denomina “reportero” pues su expresión deriva en la producción de una molécula luminiscente. Esta emisión de luz puede medirse con gran exactitud y con este dato se puede inferir el nivel de expresión del gen de interés.

Comparando los datos obtenidos usando las secuencias regulatorias en sus dos variantes -la que favorece la formación del cuádruplex y la que lo dificulta- pudieron corroborar en todos los casos que la presencia del cuádruplex alteraba la expresión génica de la manera esperada. Además, explica Lorenzatti: “Pudimos comprobar que cuando se altera la formación del cuádruplex, hay variaciones en la expresión del gen y que eso se debe a cambios que genera el cuádruplex para el acceso de la maquinaria celular necesaria para la lectura del gen”.

Incluso pudieron reforzar estos datos estudiando directamente la expresión de uno de los genes de interés seleccionados. Según detalla Lorenzatti, usaron una línea celular que expresa naturalmente F7, un gen que si no se expresa normalmente genera una coagulopatía hereditaria, y pudieron ver cómo estabilizando o desestabilizando los cuádruplex obtenían un efecto en la expresión que apoyaba la predicción inicial.

Emoción científica y ganas de seguir

En relación al proceso que llevó a esta publicación, Piga expresa: “Fue muy emocionante porque empezó como una exploración bioinformática y avanzamos en base a los resultados que apoyaban las predicciones. Hubo muchas horas de trabajo de mesada, y algunos experimentos fallidos también, pero fue muy satisfactorio el proceso de ver cómo nuestras hipótesis se iban confirmando con los experimentos”.

El trabajo continúa con una estrategia complementaria de búsqueda de asociaciones, dirigida a cáncer y oncogénesis, que consiste en buscar dentro de las bases de datos de cuádruplex identificados en el genoma humano, qué cambios de secuencia podrían afectarlos. “Se mezcla un poco el concepto de ciencia básica y aplicada; el conocimiento que aporta la ciencia básica es muy valioso y muchas veces puede derivar en desarrollos de mucha utilidad”, resalta Piga.

En ese sentido, también, Armas revela que se encuentran en etapas iniciales de colaboración con una empresa dedicada la medicina de precisión: “Estamos diseñando paneles de secuenciación para buscar nuevas variantes como las que identificamos nosotros en regiones reguladoras de oncogenes que forman cuádruplex. Es el siguiente paso que nos gustaría dar una vez que logramos este gran avance de caracterización desde lo bioinformático hasta la célula”, asegura entusiasta.